利用SW檢測篩選文庫中的β?M和CIITA低表達(dá)的克隆（分別抑制HLA-1和HLA-2）（圖1左）。使用RePlex™模塊通過NIR熒光通道在第二輪檢測總蛋白（圖1右）。類似方法用于篩選KAR配體表達(dá)（圖2）。

圖 1 Simple Western 篩選 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex™ 模塊用于在探針 1（左）中同時檢測 β2M 和 CIITA，在探針 2（右）中通過 NIR 檢測總蛋白。

圖3 顯示的是以野生型為對照，量化各克隆的敲低百分比，并將流式與Simple Western 進(jìn)行對比。

圖 3  通過流式及Simple Western敲低靶蛋白的數(shù)據(jù)對比。數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量為100%，敲低為0%）。靶點CIITA和BAT3未在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)中展示， 可能是由于它們的細(xì)胞內(nèi)定位導(dǎo)致流式檢測結(jié)果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化數(shù)據(jù)改在表4中呈現(xiàn)。

Simple Western顯示多數(shù)克隆的靶點敲低率高于流式（圖3，表2）?？寺?7對5個靶點的敲低具有良好效果（除BAT3為69%外，其余均低于野生型50%）。

表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 數(shù)值表示相對于野生型對照的百分比表達(dá)量（野生型表達(dá)量設(shè)為100%，敲低為0%）

03. 殘留Cas9篩選

CRISPR-Cas9工程化iPSCs需監(jiān)測殘留Cas9，Simple Western檢測顯示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重組對照（圖4）

經(jīng)基因改造成為通用低免疫原性供體的iPSCs需在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行功能驗證。在此環(huán)節(jié)中，Simple Western技術(shù)相比于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法，在以下幾個方面展現(xiàn)出它的優(yōu)勢：

(1) Simple Western儀器可無差別檢測全細(xì)胞裂解液、表面蛋白及純化蛋白，全程僅需3小時且無需人工操作。

(2) 傳統(tǒng)Western blot方法可輕松轉(zhuǎn)移至Simple Western平臺。作為毛細(xì)管電泳免疫分析，其提供尺寸特異性及抗體靶向檢測，已驗證抗體超5,000種。

(3) Simple Western檢測僅需 3 μL 微量樣本, 無需延長細(xì)胞培養(yǎng)。

(4) Simple Western具有高重復(fù)性、高靈敏度及定量分析功能。作為開放式毛細(xì)管Western blot技術(shù)平臺，Simple Western用戶可自由選用任何商業(yè)化或定制抗體，實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白及其異構(gòu)體的特異性檢測。

* 參考文獻(xiàn):

1. Koga K, Wang B, Kaneko S. Current status and future perspectives of HLA-edited induced pluripotent stem cells. Inflamm Regen. 2020 Oct 1;40:23.

2. Riolobos L, Hirata RK, Turtle CJ, Wang PR, Gornalusse GG, Zavajlevski M, Riddell SR, Russell DW. HLA engineering of human pluripotent stem cells. Mol Ther. 2013;21(6):1232–1241.

3. DeSandro A, Nagarajan UM, Boss JM. The bare lymphocyte syndrome: molecular clues to the transcriptional regulation of major histocompatibility complex class II genes. Am J Hum Genet. 1999;65(2):279–286.

4. Xu H, Wang B, Ono M, Kagita A, Fujii K, Sasakawa N, Ueda T, Gee P, Nishikawa M, Nomura M, Kitaoka F, Takahashi T, Okita K, Yoshida Y, Kaneko S, Hotta A. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility. Cell Stem Cell. 2019 Apr 4;24(4):566-578.e7.

5. Kitano Y, Nishimura S, Kato TM, Ueda A, Takigawa K, Umekage M, Nomura M, Kawakami A, Ogawa H, Xu H, Hotta A, Takasu N, Tsukahara M. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 May 29;26:15-25.

* 本文轉(zhuǎn)載自「ProteinSimple」微信公眾號